Изучение и оценка канцерогенеза

Канцерогенез изучается с помощью различных стандартизированных токсикологических тестов. Первая часть этих тестов проводится in vitro, и, если они положительны, мы приступаем к экспериментам in vivo. Этот экспериментальный пошаговый подход называется ПОДХОДОМ К ТОЧКЕ РЕШЕНИЯ, последовательность испытаний, которые останавливаются в конце каждого испытания, чтобы решить, как продолжить испытание. Всего пять этапов:

ФАЗА А: структура и характеристики канцерогенного соединения;

PHASEB: на этом этапе краткосрочного тестирования in vitro используются клетки млекопитающих. Наиболее часто используемые клетки - это гепатоциты, потому что степень восстановления повреждений, которые развивает гепатоцит, изучается в зависимости от тяжести повреждения, вызванного веществом. Короче говоря, мы определяем не повреждение как таковое, а то, какая часть системы восстановления была активирована клеткой печени.

Проведенная процедура заключается в формировании 3 культур гепатоцитов.В первой культуре гепатоциты здоровы, во второй их обрабатывают исследуемым веществом и, наконец, в третьей - контрольным веществом, которое определенно является канцерогенным. Эти три культуры содержат радиоактивное пиримидиновое основание, представляющее собой меченный тритием тимидин, который действует как маркер.

Если исследуемое соединение вызывает мутацию в ДНК, клетка реагирует на эту проблему, активируя системы репарации. Часть ДНК, подвергшаяся мутации, разрезается, и благодаря действию ДНК-полимеразы недостающий фрагмент заменяется новым.Для коррекции ДНК-полимераза использует новые основания, в том числе меченный тритием тимидин. Встраивается радиоактивное основание. Анализ радиоактивности определяет уровень мутации в обработанных клетках: чем выше радиоактивность, тем больше мутации ДНК.

Также в фазе B тесты также проводятся на бактериях, чтобы иметь возможность изучить, есть ли какие-либо обратные мутации. Используемые бактерии являются сальмонеллами, уже носителями мутаций. Мутация касается синтеза гистидина, поэтому сальмонеллы не могут расти без гистидина. Эти бактериальные колонии частично обрабатывают исследуемым веществом, частично для отрицательного контроля и частично для положительного контроля, а затем тестируют с помощью известного канцерогена. Если это тестируемое вещество является непрямым генотоксичным, в культуральную среду необходимо ввести метаболизирующие ферменты. На данный момент есть 3 культуры, которые будут засеяны и выращены в чашках Петри (в культуральной среде нет гистидина). Если не было никаких мутаций, вызванных канцерогеном, который необходимо проверить, теоретически на чашках их не должно быть. .Если канцероген имел мутагенное действие, он мог изменить первую мутацию и создать вторую мутацию, способную выращивать бактерии на культуральной среде без гистидина. В этом случае вторая мутация, которая изменяет первую мутацию и берет название РЕТРОМУТАЦИЯ. Наконец, если происходит значительный рост пиаста Петри, канцероген является прямым.
Всегда с помощью теста in vitro можно определить хромосомную целостность. Этот тест всегда проводится на клетках млекопитающих и используется для проверки токсичных веществ, способных вызывать мутации некоторых ферментов, ответственных за биосинтез ДНК. Вещество, подлежащее тестированию подвергается анализу in vitro. Чтобы определить, влияет ли исследуемое вещество на целостность и количество хромосом, используется тест на микроядер. Микроядра - это везикулы, которые образуются с частью хроматина внутри. Хроматин, включенный в эти микроядра, может быть либо целыми хромосомами, либо фрагментами хромосом. распределено. Результатом этого теста будет определение веществ, которые определены как кластогенные и веретенообразные яды. Кластогенное вещество образует микроядра с ацентрическими фрагментами хромосом, поэтому это вещество вызывает разрыв хромосом, а отравляющее вещество веретена производит микроядра, внутри которых присутствуют целые хромосомы.
Если исследуемое вещество вызывает генотоксичность в одном или нескольких тестах, это определяется как очень подозрительное, поэтому оно переходит непосредственно в фазу D. Если, с другой стороны, тестируемое вещество не оказывает какого-либо генотоксического действия, оно переходит в фазу исследования. C, потому что он может быть промоутером.

FASEC: на этом этапе можно проводить тесты как in vitro, так и in vivo.

Для тестов in vitro можно было продемонстрировать возможность промоторного вещества разрушать щелевые соединения между нормальными клетками и опухолевыми клетками с последующим прохождением веществ между двумя клетками.

Тест in vivo - это индукция кожных опухолей у мышей. Исследуемое вещество наносят на кожу мыши два-три раза в неделю. В течение 2/3 месяцев, если это вещество является промотором, могут образоваться папилломы. Для мышей учитываются два основных показателя: количество мышей, пораженных папилломами, и количество папиллом, присутствующих на каждом животном. Если вещество действует как промотор и вызывает опухоль у обработанной мыши, это означает, что это действительно вещество с эффектом промотора.

После завершения этих тестов мы переходим к долгосрочным тестам in vivo.

FASED: на этом этапе тестируются все соединения, которые доказали свою мутагенность, и все соединения, которые не доказали мутагенность. Можно выполнить разные тесты, некоторые из которых проводятся на печени, легких и, наконец, груди.

Печеночная проба демонстрирует образование не новообразованной опухоли, а неопластического очага, следовательно, что-то, что готовится стать опухолью. Клетки этого очага уже являются атипичными клетками, поэтому они претерпели мутацию и готовятся стать неопластическими клетками. Через определенное время, благодаря аутопсическому исследованию, определяется формирование предопухолевых очагов путем подсчета количества и степени этих предопухолевых образований.

Легочный тест позволяет определить аденому, которая является «аномалией клеток легочной ткани». Также в этом случае легочная ткань крысы исследуется через довольно длительное время (месяцы) (эти аденомы легко идентифицировать, потому что беловатые узелки на легочном эпителии).
Тест груди позволяет определить опухоль в железистой ткани. Всегда оценивают количество образовавшихся аденом и количество животных с аденомами.

Если результаты этих тестов положительны, тестируемое вещество действительно является канцерогеном. На этом этапе мы переходим к проведению дорогостоящих тестов с очень длительным временем выполнения.

PHASEE: на этом этапе длительным тестам подвергаются переменное количество животных от 20 до 50. Эти тесты очень дороги и требуют много времени для получения определенных результатов; мы говорим о 1/8 жизни животного.Возможно, что в процессе этих тестов некоторые животные погибнут, но они всегда изучаются с помощью вскрытия и гистологического исследования. Выбираемые животные всегда - это крысы и мыши, и только 70-80% выживают до конца долгосрочных тестов. Используемые животные просто отлучены от груди, поскольку чем они моложе, тем они более чувствительны к лечению. В течение длительного периода тестирования исследователя всегда поддерживает математик-статистик, способный учесть всю собранную информацию и воспроизвести различные данные.

Дозы, тестируемые на животных, начинаются с максимально переносимой дозы и всех ее кратных, после чего оценивается доза-ответная реакция у животного.
При введении всегда необходимо соблюдать тот путь, которым человек может вступить в контакт с исследуемым веществом, то есть оральный, кожный или респираторный путь, в то время как, если проверяется канцерогенность лекарственного средства, также полезно выполнять внутривенное введение.
Были протестированы 4 группы животных (по 50 животных в каждой группе):

Группа NAIF, не имеющая лечения;
Группа, получавшая транспортное средство;
Группа, получавшая исследуемое вещество;
Группа, получавшая известный канцероген.

Очень важно, чтобы количество животных в каждой группе было как можно более равным, ведь, если количество животных слишком велико, статистический тест может оказаться ложным.
Выполняемые оценки:

Общая частота опухолей;
Частота некоторых опухолей;
Частота животных с более чем одним типом опухолей;
Количество раковых заболеваний животных.

В конце всех этих этапов исследования вещество классифицируется в рейтинге, установленном IARC (Международное агентство исследований и разработок в области рака) и Агентством по охране окружающей среды (EPA).